《表3 sgRNA1和sgRNA2脱靶位点的核苷酸序列》

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《应用CRISPR/Cas9和Cas9-D10A建立Nsun5基因敲除小鼠模型并分析脱靶效应》

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PAM序列显示为绿色。碱基错配显示为红色。

为了检测这两种策略得到的基因敲除首建鼠是否存在脱靶效应，选取由Cas9/sgRNA和Cas9-D10A/sgRNA构建的Nsun5基因敲除首建鼠各3只（Cas9:5号、7号、12号；Cas9-D10A:1号、2号、6号），分析并对比Cas9和Cas9-D10A得到首建鼠的脱靶效应。首先针对两个sgRNA各预测了10个最容易发生脱靶效应的位点（表3），然后设计引物进行PCR扩增，之后进行T7EN1酶切检测脱靶效应（图2）。从图中可以看出，和对照相比，选取的6只小鼠针对sgRNA1和sgRNA2潜在的20个脱靶位点均无突变，对T7EN1酶切有切割条带的PCR产物，进行了T-A克隆测序验证，发现对应的PCR产物存在单核苷酸多态性或由重复序列导致的Taq酶扩增错误。