《表2 小鼠胚胎显微注射Cas9 mRNA和sgRNA统计》

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《应用CRISPR/Cas9和Cas9-D10A建立Nsun5基因敲除小鼠模型并分析脱靶效应》

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应用CRISPR/Cas9做基因敲除时，只有合理设计sgRNA，才能将靶基因彻底敲除。根据经验，将sgRNA设计在目标基因编码序列（coding sequence，CDS）的前1/3处时，在该处切割，发生DNA双链断裂，通过机体NHEJ修复，产生移码突变，能够导致基因彻底敲除；如果sgRNA距起始密码子ATG太近，机体会在起始密码子下游找到另一ATG充当起始密码子，仍会合成有功能的蛋白；而如果sgRNA距起始密码子ATG位置太远，会导致该基因前面的功能域保留，致使敲除不彻底。根据以上原则，结合报道的Paired sgRNA/Cas9-D10A设计策略[11]，本研究将1对sgRNA设计在Nsun5基因3号外显子上（图1A），通过体外转录得到Cas9 mRNA、Cas9-D10A mRNA和sgRNA，利用原核注射技术体外将转录的RNA注射到小鼠一细胞期受精卵中，移植后，Cas9/sgRNA组出生17只首建鼠；Cas9-D10A/sgRNA组出生7只首建鼠（表2）。