《表5 BE4max系统编辑小鼠胚胎对发育率和突变率的统计》

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《小鼠及猕猴胚胎MECP2基因T158M单碱基突变体系的建立》

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为了探究BE质粒和sgRNA的mRNA最佳浓度以及质量控制后mRNA对胚胎发育的稳定性，选取了小鼠胚胎作为实验对象，共用了4个浓度组合（BE4maxP2A-GFP∶T158M-sgRNA=20∶10、50∶20、100∶50和200∶100），进行了3次重复，结果表明不同注射浓度对胚胎发育率和编辑效率影响不同。低浓度组合（BE4max-P2A-GFP∶T158M-sgRNA=20∶10、50∶20）囊胚发育率较高，但统计发现被编辑的胚胎个数少，突变率（指通过Sanger测序分析胚胎是100%纯合突变还是嵌合体，嵌合突变的比例）低。浓度组合为200∶100时，突变率高而囊胚率较低。综上结果，筛选了100∶50为胚胎注射的最优组合（表5），运用T7酶切和Sanger测序的方法测定编辑后胚胎基因组序列并观察基因测序峰图（图3），发现在设计的sgRNA序列PAM位点（从5'～3'）第5个和第7个碱基出现了C→T的突变，第5个碱基由C→T，基因序列由TTC变成TTT，由于密码子的简并性，并没有改变氨基酸的类型，依然为苯丙氨酸，而第7个碱基由C→T的突变，引起了氨基酸由苏氨酸改变为甲硫氨酸，说明了BE基因编辑系统实现了准确的定点突变。