《表1 Ta PIF4基因PCR及qRT-PCR扩增所用引物序列Tab.1 Primers used for Ta PIF4 gene PCR and qRT-PCR amplification》

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《小麦光敏色素互作因子TaPIF4基因的克隆与表达分析》

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国家小麦工程技术研究中心小麦遗传育种研究室前期采用Illumina/Solexa基因测序技术对不同光周期处理下辽春10号小麦品种进行了光周期发育转录组文库构建和数字基因表达谱差异分析[22]。本研究从所得的光周期表达谱中进行筛选，得到光周期相关基因的EST序列，在NCBI网站的nr数据库中进行Blast比对分析，因与粗山羊草的PIF4-like基因高度同源且有较高一致性，故命名该基因序列为Ta PIF4。利用Primer Premier 5.0在该序列开放阅读框（ORF）的5'和3'非编码区设计2条引物（表1）用于ORF片段的扩增。小麦叶片DNA的提取采用CTAB法，小麦总RNA的提取参照Invitrogen的TRIzol试剂盒说明书，取1μg RNA，使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒（TaKaRa公司）进行反转录合成第一链cDNA。PCR反应体系参照Ta KaRa公司的PremiSTAR Max DNA Polymerase说明书配制，体积为20μL:2×PCR Prime STAR Max Premix 10μL、10μmol/L上下游引物各0.5μL、模板1μL，用ddH2O补齐至20μL。以辽春10号cDNA为模板时，PCR反应条件为:95℃预变性3 min；95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，35个循环；72℃最后延伸10 min。以DNA为模板时，PCR反应条件为:95℃预变性3 min；95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸3 min，35个循环；72℃最后延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，切下目的条带，经回收后与pMD19-T载体连接，然后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆后送至公司进行测序分析。