《表1 基因Mf ILKAP和Sj TA扩增引物序列》

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《筛选和鉴定与东方田鼠抗性基因ILKAP表达蛋白相互结合的日本血吸虫童虫蛋白》

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注:下划线代表限制性核酸内切酶的酶切位点

运用Primer Premier 5.0软件设计东方田鼠-ILKAP（Mf ILKAP）和日本血吸虫表膜抗原（tegumentantigen，TA）（Sj TA） 全长的上下游扩增引物，引物由北京华大基因公司合成，并在上、下游引物的5′端分别加入酶切位点和保护性碱基，引物序列如表1。分别以东方田鼠骨髓cDNA和日本血吸虫童虫cDNA为模板，RT-PCR扩增Mf ILKAP基因和Sj TA基因。将质粒pCMV-Tag 2b、pcDNA3.1myc-His（-）b接种于LB培养基中，37℃、200 r/min培养16 h，采用质粒提取试剂盒提取质粒。用SmaⅠ和NotⅠ酶切Mf ILKAP和质粒pCMV-Tag 2b，HindⅢ和NheⅠ酶切Sj TA和质粒pcDNA3.1/myc-His（-）b，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后分别切胶回收。回收Mf ILKAP和pCMV-Tag 2b TA片段，分别与质粒pcDNA3.1/myc-His（-）b以5∶1的比例混合，T4 DNA连接酶连接过夜，连接产物分别转化至大肠埃希菌感受态细胞，氨苄青霉素筛选Myc-TA-pcDNA3.1/（-）b阳性克隆，卡那霉素抗性平板筛选Flag-ILKAP-pCMV-2b阳性克隆，小量培养后提取质粒进行双酶切鉴定。