《表1 核糖体RNA基因片段PCR引物序列及Genbank序列号Tab.1 PCR primers information for different ribosomal RNA gene fragm

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《长臂缨鲆核糖体RNA基因序列多态性特征分析》

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注:ITSZ包括ITS1、5.8S和ITS2；*表示不是全长序列；“—”表述无此序列。

对测定的序列利用局部对比基本检索工具（Basic Local Alignment Search Tool，BLAST）网站（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov）进行检索，18S、5.8S以及28S序列通过与鲽形目中近缘物种的相似性确定是否为目的片段；ITS1与ITS2序列则通过两端的18S、5.8S、28S序列的相似性进行判断；提交美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）数据库获得Genbank号（表1）。应用Clustal X2.0（Larkin et al，2007）软件进行序列比对；并用Bio Edit（version 7.0.1）（Hall，1999） 软件对序列进行人工调整；使用MEGA 6.0（Tamura et al，2013）软件统计序列保守位点、变异位点及碱基组成；应用DNAsp 5.0（Librado et al，2009）软件统计单倍型及单倍型多样性、核苷酸多样性及平均核苷酸差异数。应用RNAfold在线网站（http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWeb Suite/RNAfold.cgi）预测序列最小自由能；应用软件RDP4.85（Martin et al，2015）和Sim Plot 3.5（默认参数值）以及序列比对检测重组片段，并辅以人工校对。应用MEGA 6.0软件采用邻接法（neighbor-joining method，NJ），应用双参数模型（Kimura 2-parameter distance，K2P），对长臂缨鲆核糖体RNA不同片段的克隆序列聚类分析，置信值检测（bootstrap test）1000次重复。