《表1 重叠PCR扩增JD4嵌合全长克隆构建片段引物序列Tab.1 Primers used in amplification of fragment in constructing JD4 full

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《乙脑/登革4型嵌合病毒的构建及其小鼠神经毒力测定》

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注:黑体字母为沉默突变后的酶切位点。

JD4嵌合感染性全长克隆的构建采用双质粒系统。将乙脑减毒疫苗株JEV SA14-14-2基因组的5'端序列（第1～3 446核苷酸）和3'端序列（第3 446～10 976核苷酸）分别插入到质粒载体p AC-NR，构建成乙脑减毒疫苗株SA14-14-2的两个半分子克隆，分别命名为pACNR-5'JEV和pACNR-3'JEV[12]。然后，用F1和R1作为引物，PCR扩增登革病毒4型H241株的prME基因片段，用F2和R2作为引物，PCR扩增乙脑减毒株SA14-14-2疫苗株的NS1蛋白前177个核苷酸片段，反应体系均为50μL，反应条件为:98℃预变性40 s；98℃变性10 s，60℃退火15 s，72℃延伸40 s，共30个循环；72℃延伸5 min。以上述两个片段为模板，用引物F1和R2通过重叠PCR将两个片段融合，反应体系为50μL，反应条件为:98℃预变性40 s；98℃变性10 s，72℃延伸60 s，共30个循环；72℃延伸5 min。用限制性内切酶Nar I和Bgl II酶切后替换到pAC-NR-5'JEV构建成乙脑/登革4型的嵌合5'半分子pACNR-5'JD4。由于在DENV-4 prME基因第1 063～1 068核苷酸处中存在BspE I位点，在第1905～1 910核苷酸处存在Xho I酶切位点，为便于后面的全长连接，需将该两个位点去掉。研究采用重叠PCR定点突变技术对该两个位点进行沉默突变。设计两对分别包含两个酶切位点且反向互补的引物F3/R3（包含BspEI位点）和F4/R4（包含Xho I位点），改变酶切位点中的1个核苷酸但又不能影响氨基酸的编码。用F1和R3、F3和R4、F4和R2 3对引物扩增3个片段，然后以3个片段为模板，以F1和R2为引物通过重叠PCR将3个片段融合后，反应体系和反应条件和上述融合PCR扩增条件相同。用限制性内切酶Nar I和Bgl II酶切后替换到pACNR-5'JEV构建成乙脑/登革4型的嵌合5'半分子pACNR-5'JD4-S。最后将p ACNR-3'JEV分子中的乙脑片段第3 446～10 976核苷酸用限制性内切酶BspE I和Xho I酶切后插入到pACNR-5'JD4-S，构建成JD4感染性全长克隆pACNR-JD4FL。PCR扩增所用引物序列，见表1。