《表1 引物序列及退火温度》

  提示：宽带有限、当前游客访问压缩模式

本系列图表出处文件名：随高清版一同展现

《鹅掌楸LcKNOX3转录因子基因全长克隆及组织表达特异性分析》

1. 获取 高清版本忘记账户？点击这里登录

1. 下载图表忘记账户？点击这里登录

根据本实验室自建的转录组数据库的功能注释信息（Yang et al.，2014），检索KNOX基因，选择EST序列。以第一链cDNA为模板，利用Oligo7软件在EST序列上设计中间片段引物（cDNA fragments F，cDNA fragments R），反应体系:50μL（cDNA 1μL，primer F 1μL，primer R 1μL，PrimeSTAR高保真酶25μL，ddH2O 22μL），PCR程序为:98℃预变性5 min；98℃变性30 s，退火温度退火30 s（表1），72℃延伸30 s；30个循环；72℃延伸5 min；4℃保存。通过1.5%琼脂糖电泳检测PCR产物，切胶回收目的条带，连接至pEASY-Blunt载体并将重组子转化大肠杆菌Trans5α感受态细胞，涂板后进行蓝白斑筛选，挑取单一白色菌落，将阳性克隆送至公司测序。在中间片段序列上设计3'RACE引物，采用TaKaRa PrimeSTAR高保真酶，按照上述反映体系，进行PCR扩增，以3'RACE cDNA为模板，利用Oligo7软件在中间片段序列上设计3'RACE引物（3'RACE outer，3'RACE inner），使用TaKaRa PrimeSTAR高保真酶，按照中间片段反应体系进行3'RACE PCR扩增。以5'RACE cDNA为模板，使用TaKaRa PrimeSTAR高保真酶，在中间片段序列上设计5'RACE引物（5'RACE outer，5'RACE inner），按照上述反应体系进行5'RACE PCR扩增，将得到的3个片段拼在一起，即基因全长。在NCBI ORF finder网站上在线预测LcKNOX3基因的开放阅读框，并在起始密码子和终止密码子的位置设计ORF引物（ORF F，ORF R）以cDNA为模板进行扩增，确保开放阅读框正确。上述实验所使用的引物名称及序列如下（表1）。