《表1 引物序列、退火温度及产物长度》

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《牦牛TSHB、DIO2和DIO3基因的克隆及其在繁殖轴的表达研究》

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选用Trizol法提取牦牛各组织总RNA，用紫外分光光度计检测总RNA浓度和纯度，将A260/A280在1.8-2.1之间的RNA，用反转录试剂盒合成cDNA。根据GenBank上普通牛TSHB基因序列（NM＿174205.1）、DIO2基因序列（AY858551.2）和牛DIO3基因序列（AY858552.1），用Primer Premier5.0设计PCR克隆引物（表1），PCR扩增总体系为10μL，上下游引物（10mmol/L）各1μL，2×Long Taq PCR Mix 5μL，cDNA模板1μL和2μL ddH2O。扩增条件:95℃预变性3min，95℃变性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸80s，35个循环，72℃延伸10 min，扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后进行胶回收，将目的片段与p MD19-T载体连接后，转化到DH5α感受态细胞中，均匀涂布到含有0.1%氨苄的LB固体培养基上，37℃恒温培养24 h，挑取单个菌落进行目的基因检测，送至成都擎科梓熙生物技术有限公司测序。