《表1 耐药基因的引物序列、产物大小及退火温度》

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《碳青霉烯耐药非产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的药物敏感性及分子特征分析》

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采用煮沸法提取细菌基因组DNA。取2μL上清液作为PCR模板。PCR反应体系为50μL，其中，2×PCR Master Mix 25μL，DNA模板2μL，20μmol/L上、下游引物各2μL。用PCR法扩增检测碳青霉烯酶基因（blaKPC、blaIMI、blaSME、blaGES、blaVIM、blaIMP、blaNDM、blaGIM和blaOXA-48）[7]，排除假阴性菌株；进一步检测ESBL编码基因（blaSHV、blaTEM、blaCTX-M、blaGES、blaPER和blaVEB）[8]和质粒介导的Amp C基因（blaDHA-1、blaCMY、blaFOX和blaMOX）[8]。引物序列参考文献[7-8]设计，引物序列、产物大小及退火温度见表1。PCR反应条件:94℃10 min；94℃40 s，退火40 s，72℃1 min，共30个循环。对于基因检测阳性的菌株送PCR产物至上海生物工程有限公司测序。测序结果使用Chromas-Pro1.7.5软件（澳大利亚Technelysium公司）进行初步分析，再使用BLAST（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）进行比对分析。