《表4 克隆PeDREB2A和PeWRKY19启动子不同片段所用引物序列》

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《胡杨DREB2A和WRKY19基因启动子逆境响应元件及其功能分析》

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注:酶切位点用下划线表示Note:Enzyme cutting sites were underlined

以胡杨基因组DNA为模板，利用DNAMAN软件分别设计引入酶切位点Bam HⅠ和BglⅡ的特异引物（表4），PCR扩增启动子目的片段，PCR反应体系:2×Taq PCR Mix 10μL，上游引物1μL，下游引物1μL，胡杨基因组DNA 2μL，ddH2O 6μL。PCR反应程序:95℃预变性5 min；95℃变性30 s、50℃退火30 s、72℃延伸2 min，35个循环；72℃延伸5 min。将不同片段PCR产物与pUC-T载体（Promega，北京分公司）连接，连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有100 mg/L Amp的LB固体培养基上进行蓝白斑筛选，挑取白色单菌落进行菌液PCR鉴定后提取质粒，PCR验证并与pCAMBIA1301质粒分别以Bam HⅠ和BglⅡ进行双酶切。酶切片段与去除CaMV35S启动子的pCAMBIA1301载体片段连接后的重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有50 mg/L Kana的LB固体培养基上筛选阳性单菌落后置于摇床37℃培养过夜，提取质粒，PCR验证后采用冻融法导入农杆菌感受态GV3101，在含有50 mg/L Kana和50 mg/L Rif的LB固体培养基上筛选阳性克隆。