《表1 实时荧光定量PCR特异性引物》

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《MAIT细胞恒定链Jα33在IgA肾病患者中的表达及意义》

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以β-action蛋白作为内部参照基因，以Primer 5.0设计MAIT恒定链vα19-jα33及β-action蛋白基因的引物（表1）。利用淋巴细胞分离液分离外周血细胞获得PBMC，利用TRIzol试剂盒按照说明书步骤提取PBMC及肾穿组织的总RNA，取RNA样本1μg，逆转录按照试剂盒要求进行，反应条件:37℃15 min，85℃5 s。实时定量RT-PCR:20μL反应体系中含有SYBR GreenⅠ10μL，c DNA 2μL，引物F和引物R各0.8μL（10μmol/L），双蒸水6.4μL。反应条件:预变性:93℃35 s；扩增:95℃变性5 s，60℃退火、延伸各25 s，共40个循环；融解曲线:96℃变性15 s，60℃退火1.5 min，95℃变性0 s；降温:40℃降温30 s。仪器自动报告出Ct值，采用相对定量法进行定量，以β-action蛋白为参照，利用Ct值计算Jα33和β-action m RNA的相对量。Ct为循环阈值，△Ct=样品Ct均值-内参照Ct均值，△△Ct=△Ct-（随机阴性对照样品Ct均值-该样品内参照Ct均值），以2-△△Ct表示样品中目的基因初始c DNA相对表达量[7]。对扩增产物进行SDS-PAGE电泳分析其特异性。