《表3 实时荧光定量PCR特异性引物序列及探针》

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《酵母水解物对断奶仔猪生长性能、血清免疫和抗氧化能力及粪便菌群的影响》

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按照粪便DNA提取试剂盒（Omega，美国）说明书提取直肠粪便中的DNA，利用荧光定量PCR仪（CFX96，Bio-Rad，美国）测定其总菌、大肠杆菌、乳酸杆菌、双歧杆菌和芽孢杆菌的数量。根据细菌的16S rRNA基因序列设计相应的特异性引物（表3）。参照刁慧[15]的方法，应用Taqman探针进行荧光定量PCR，利用Real Master Mix探针[天根生化科技（北京）有限公司，中国]进行检测。大肠杆菌、乳酸杆菌和芽孢杆菌的反应体系包括:8μL Real Master Mix、1μL Probe Ehancer Solution、上游和下游引物各1μL、0.3μL探针、1μL DNA和7.7μL ddH2O；双歧杆菌的反应体系包括:8μL Real Master Mix、1μL Probe Ehancer Solution、上游和下游引物各1μL、0.8μL探针、1μL DNA和7.2μL ddH2O。采用三步法扩增标准程序:95℃预变性10 s，95℃5 s，50~60℃25 s，95℃10 s，共50个循环。总菌反应体系为25μL:SYBR Premix Ex TaqTMⅡ12.5μL、上游和下游引物各1μL、DNA 1μL和ddH2O 9.5μL。采用三步法PCR扩增标准程序:95℃预变性10 s，95℃5 s，50~60℃25 s，95℃10 s，熔解曲线条件为95℃39 s、55℃1 min、95℃1 min，共40个循环。以每克内容物为检测单位，计算方法参照Qi等[16]，结果用每克内容物中菌落形成单位（CFU）的常用对数[lg（CFU/g）]表示。