《表1 引物和探针序列：柯萨奇病毒A组6型TaqMan一步法实时荧光定量PCR方法的建立》

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《柯萨奇病毒A组6型TaqMan一步法实时荧光定量PCR方法的建立》

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注：下划线序列为T7启动子序列。

以本实验室分离并鉴定为CV-A6的毒株KYN-A1205（基因登录号：MN184853）作为模板，设计扩增引物CV-A6-VP1-F和CV-A6-VP1-R，其中上游引物包含T7启动子，且该对引物包含CV-A6-qP-F、CV-A6-qP-R引物及CV-A6-probe。采用病毒RNA扩增试剂盒进行RT-PCR反应，阳性PCR产物经琼脂糖凝胶试剂盒回收后利用DNA加尾试剂盒对其3′末端加“A尾”；与pMD18-T Vector连接并转化DH5α感受态细胞，菌落PCR确定阳性克隆；利用质粒提取试剂盒提取质粒，送往硕擎（昆明）生物技术有限公司并用pMD18-T Vector通用引物M13F和M13R测序确定目的片段插入的方向；Sal I限制性内切酶将重组质粒线性化后切胶回收；体外转录试剂盒转录出目的RNA，并用紫外分光光度计测定其水平；根据公式计算拷贝数：单位体积RNA拷贝数（copy/mL)=6.02×1023×（X g/mL）/（RNA碱基数×340)，RNA于-20℃保存备用。其中，本实验所用到的引物和探针序列见表1。