《表1 实验所用引物：燕麦蛋白激酶基因AsSnRK2.10的克隆及非生物胁迫响应分析》

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《燕麦蛋白激酶基因AsSnRK2.10的克隆及非生物胁迫响应分析》

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下划线：酶切位点

利用Mini BEST Plant RNA Extraction Kit试剂盒进行植物组织总RNA的提取。参照Prime Script?Ⅱ1st Strand c DNA Synthesis Kit说明书进行逆转录合成第一链c DNA。利用波兰小麦（Triticum polonicum） Sn RK2.10 （Gen Bank No.KF688099.1）编码区上游和下游长度为100 bp的核苷酸序列作为检索序列，Blast干旱胁迫的燕麦转录组数据的注释结果（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRX2996463），下载一致性较高的Reads，进行多序列比对。基于比对结果，利用特异性引物2.10f1和2.10r1 （表1）进行As Sn RK2.10基因编码区的PCR扩增。以干旱胁迫24 h燕麦叶片的第一链c DNA作为模板，利用Prime STAR?Max DNA Polymerase进行PCR扩增，获得As Sn RK2.10基因编码区。PCR扩增体系（50μL）:dd H2O 20μL，2×Prime STAR Max Premix 25μL，10μmol/L上下游引物各2μL，第1链c DNA 1μL。PCR扩增条件：98℃变性10 s，57℃退火5 s，72℃延伸20 s，30个循环。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的片段，借助DNA A-Tailing Kit进行c DNA片段的3'末端添加一个碱基A。加A的c DNA片段经DNA产物纯化试剂盒产物纯化后克隆至p MD?18-T载体上，将p MD?18-T-AsSn RK2.10重组DNA热击转化大肠杆菌（DH5α）感受态细胞，筛选阳性克隆进行测序。