《表1 实验所用引物信息：灰葡萄孢丝裂原活化蛋白激酶编码基因bmp1和bmp3的功能》

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《灰葡萄孢丝裂原活化蛋白激酶编码基因bmp1和bmp3的功能》

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根据bmp1和bmp3基因的c DNA序列设计基因特异性引物（表1）。提取灰葡萄孢野生型菌株的RNA，反转录合成c DNA，用高保真的LA-Taq对bmp1和bmp3基因的特异片段进行PCR扩增。PCR反应体系（50μL）:模板c DNA 2μL，10×PCR buffer（含Mg2+）5μL，dNTPs（2.5 mmol/L）8μL，上、下游引物（10μmol/L）各1μL，LA-Taq（5 U/μL）1μL，dd H2O 32μL。PCR反应条件:95°C 5 min；94°C 30 s，55°C 30 s，72°C 30 s，共32个循环；72°C 10 min。PCR扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测后，进行目的条带的回收、克隆。将目的基因片段与Gateway克隆载体p CR8进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，利用载体特异性引物M13进行阳性克隆的PCR检测，PCR检测为阳性的克隆进行测序验证，将测序鉴定正确的质粒p CR8-bmp1和pCR8-bmp3分别与RNAi载体pK7GW1WG2进行LR重组反应，反应产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，阳性克隆进行PCR检测和测序验证后进行重组质粒p K7GW1WG2-bmp1和p K7GW1WG2-bmp3的提取。