《表2 PCR反应体系：弥漫性大B细胞淋巴瘤中丝裂原活化蛋白激酶10基因甲基化的临床意义》

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《弥漫性大B细胞淋巴瘤中丝裂原活化蛋白激酶10基因甲基化的临床意义》

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（1） DNA提取:采用QIAamp DNA Extract Kit试剂盒（美国Qiagen公司生产）从石蜡组织中提取基因组DNA，用紫外分光光度仪（美国Nano-drop公司生产）测定浓度。（2）甲基化特异性（methylation-specific PCR，MSP）反应:用EZ DNA Methylation-Gold Kit试剂盒（美国ZYMO RE-SEARCH公司生产）对基因组DNA进行亚硫酸氢盐修饰，按说明书进行操作。MSP引物序列及反应条件见表1，PCR反应体系见表2。PCR反应条件:94℃预变性10min，94℃变性30s，退火温度见表1，时间30s，72℃延伸30s，共40个循环；最终延伸温度为72℃10min。PCR反应时设立阳性与阴性对照。MSP引物已测试不能扩增未经亚硫酸氢盐修饰的DNA。（3）琼脂糖凝胶电泳:PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，UV凝胶成像系统观察结果。（4）Sanger测序:随机抽取10例进行Sanger直接测序。经MSP扩增后的PCR产物5μl与2μl标准反应体系混匀，进行纯化反应。每例样本的PCR扩增产物均进行正、反双向测序。测序PCR反应所用PCR引物序列同前，测序PCR反应体系总体积10μl，包含6.75μl去离子水、0.5μl纯化PCR产物、0.5μl Bigdye、1.75μl Big Dye Seq Buffer及0.5μl引物（3.2pmol/μl）。测序PCR反应条件:96℃预变性1min，96℃变性10s，50℃退火5s，60℃延伸4min，共25个循环，末次循环4℃10min。所得测序产物经纯化后，置于Applied Biosystems 3500×L基因分析仪，采用Sequencing Analysis5.4软件分析序列并采集图像。