《表1 构建h PD-L2重组质粒所使用的引物Tab.1 Primers pairs used for constructing h PD-L2 plasmids》

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《人源程序性死亡配体PD-L2蛋白的原核表达与抗血清制备》

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注:下划线表示限制性内切酶所对应的碱基序列

1) p ET-27b-h PD-L220~123和p ET-27b-h PD-L220~208重组质粒的构建.利用Primer Premier 5.0软件分别设计h PD-L2蛋白的胞外免疫球蛋白样Ig V结构域（h PD-L220~123）和整个胞外区结构域（包括免疫球蛋白样Ig V结构域和Ig C结构域，h PD-L220~208）的引物（见表1）.以h PD-L2的DNA为模板，利用表1中的引物，进行聚合酶链式反应（PCR）大量扩增h PD-L220~123的基因片段，扩增体系为50μL，PCR的反应条件为:94℃、5 min，94℃、30 s，60.3℃、30 s，72℃、45 s，35个循环，72℃、10 min.利用相同方法大量扩增h PD-L220~208的基因片段，扩增体系为50μL，PCR的反应条件为:94℃、5 min，94℃、30 s，65℃、30 s，72℃、45 s，35个循环，72℃、10 min.同时利用Nde I和Xho I双酶切上述扩增的h PD-L220~123与h PD-L220~208的基因片段和p ET-27b载体，将二者连接，转化至DH5α感受态细胞，挑选单菌落进行PCR鉴定，将阳性菌落送至测序公司进行测序，分别将测序结果正确的重组质粒命名为p ET-27b-h PD-L220~123和p ET-27b-h PD-L220~208.提取测序结果正确的单菌落重组质粒，转化至RossetaTM（DE3）感受态细胞进行蛋白的表达与纯化.