《表1 用于构建重组质粒的引物》

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《嗜热酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy的C末端结构域功能及生淀粉结合位点分析》

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注：下划线部分为限制性酶切割位点，粗体部分为突变位点。

以重组质粒pSTOP1622-gtamyhds为模板，采用引物P1和P2进行PCR扩增（表1），获得编码催化结构域的基因gtamy-Th。PCR扩增条件为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃退火20 s，68℃延伸1 min，35个循环；68℃延伸10 min。扩增产物经Bgl II和Sph I双酶切，连接至经相同酶切处理的载体pSTOP1622，构建重组质粒pSTOP1622-gtamy-Th。以重组质粒pSTOP1622-gtamyhds为模板，采用引物P3和P4进行PCR扩增（表1），获得编码CTD的基因ctdh。重组质粒pSTOP1622-ctdh的构建方法同上。采用限制性内切酶Bgl II和Sph I共同处理重组质粒鉴定是否有外源基因的插入。