《表1 构建重组质粒引物序列》

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《重组质粒pcDNA4-FLAG-GLUT1构建及蛋白表达》

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注：下划线部分表示酶切位点，粗体部分表示引入的FLAG序列；GLUT1：葡萄糖转运蛋白1

以人类GLUT1基因编码区（1～1 479 bp）为模板，在GLUT1的第一个胞外区序列中，即在第55位氨基酸和第56位氨基酸之间插入2个连续的FLAG标签。首先进行分段PCR，分别扩增片段GLUT1-Ⅰ（GⅠ，1～165 bp）和GLUT1-Ⅰ′（GⅠ′，166～1 479 bp），并在GⅠ的上、下游分别引入HindⅢ酶切位点和2×FLAG序列，GⅠ′的上、下游分别引入部分1×FLAG序列和Bam HⅠ酶切位点。以GⅠ′为模板进一步扩增出片段GLUT1-Ⅱ（GⅡ，166～541 bp）和GLUT1-Ⅲ（GⅢ，517～1 479 bp)(PCR引物见表1）。PCR反应条件：预变性98℃5 min，以98℃30 s，55℃20 s，68℃1 min，循环35次，68℃终延伸5 min，4℃终止反应。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离鉴定，切胶回收。