《表1 构建重组质粒所用引物序列》

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《组成型分泌表达嗜热酸性生淀粉α-淀粉酶的重组粪肠球菌的构建》

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注：下划线标注的部分为限制性酶切位点。下同。

基于生淀粉α-淀粉酶Gt-amy的基因gtamy的碱基序列，设计引物P1和P2（见表1）。以重组质粒p STOP1622-gtamyhds为模板，PCR扩增基因gtamy中不含信号肽的结构基因gtamyhds。PCR扩增体系：10×buffer I 5μL，脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，d NTP)5μL，MgSO45μL，引物P1和P2各2μL，模板1μL，KOD-Plus-neo DNA聚合酶2μL，双蒸水（dd H2O)28μL。PCR扩增条件：98℃预变性5 min；98℃变性20 s，60℃退火20 s，74℃延伸2 min，30个循环；74℃再延伸10 min。PCR扩增产物经Xho I和Hind III双酶切，连接至经相同双酶切处理的载体p SIP401，构建重组质粒p SIP401-gtamyhds。将连接产物转化至E.coli JM109感受态细胞，并涂布于含200μg/m L红霉素的LB固体平板上，37℃过夜培养。挑取LB固体平板上的转化子，提取重组质粒，采用Xho I和Hind III进行双酶切，鉴定阳性重组子。