《表2 构建TH表达质粒所用引物》

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《基于地衣芽孢杆菌表达系统搭建左旋多巴新合成体系》

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注:下划线为酶切位点

依据B.licheniformis密码子偏好性优化合成srth，以合成的基因为模板，利用SnapGene软件设计2对引物，第一对引物两端引入酶切位点Nde I、Nhe I以及保护碱基，在后引物前端引入His标签；第二对引物两端引入酶切位点Kpn I、Sal I以及保护碱基，2对引物序列及酶切位点见表2。利用合成的引物扩增基因序列，扩增的基因序列回收之后加A尾后，再连接至p MD19-T载体上，命名为pMD19-T-srth1、p MD19-T-srth2，连接产物转入感受态JM109。测序正确后用Nde I和Nhe I同时酶切p MD19-T-srth1和p MA5载体，用Kpn I和Sal I同时酶切pMD19-T-srth2和p HY载体，酶切后回收目的片段SrTH1、线性化的p MA5、srth2和线性化的pHY。按照基因和载体摩尔质量比3∶1的比例各配制连接体系10μL，在16℃干式恒温器中过夜连接。将连接产物p MA5-srth、p HY-srth转入JM109，分别命名为Eco/pMH、Eco/p HH，涂布氨苄青霉素抗性平板，挑取转化子、提取质粒，经单双酶切验证正确后，将2个重组质粒采用电转化的方法转入表达宿主B.licheniformis 9945a，分别命名为Bl/pMH（胞内表达）、Bl/p HH（胞外表达）。Bl/p MH涂布卡那霉素抗性平板，Bl/pHH涂布四环素抗性平板，挑取转化子、提取质粒，经酶切验证及测序正确后，保藏菌种。