《表1 SmDAD1启动子克隆的相关引物》

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《茄子花药开裂相关基因SmDAD1启动子的克隆及功能分析》

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注：下划线部分为HindⅢ和XbaⅠ酶切位点。

2018年9月，以茄子‘F142’花药基因组DNA为模板，以DAD1-f和DAD1-r（表1）为引物，PCR扩增SmDAD1，并进行连接、转化，送北京六合华大有限公司测序。根据测序得到的DNA序列设计3条特异性下游引物SP1、SP2、SP3（表1），以花药基因组DNA为模板，用染色体步移法进行3轮PCR扩增（Terauchi&Kahl，2000；刘博等，2006）：第1轮以通用引物AP1+特异引物SP1的引物对进行扩增；第2轮以稀释100倍的第1轮扩增产物为模板，用通用引物AP2+特异引物SP2的引物对进行扩增；第3轮以稀释100倍的第2轮扩增产物为模板，利用通用引物AP3+特异引物SP3的引物对进行扩增。反应体系为50μL：模板2μL，dNTP Mixture（2.5 mmol·L-1 each）8μL，10×LA PCR BufferⅡ（Mg2+plus)5μL，TaKaRa LA Taq（5 U·μL-1）0.5μL，AP Primer（100pmol·μL-1）1μL，SP Primer（10 pmol·μL-1）1μL，用ddH2O补足体积。其中AP1、AP2、AP3和具体的PCR程序均参考TaKaRa Genome Walking Kit试剂盒。