《表2 克隆启动子的特异性引物》

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《阳春砂3个萜类合酶基因启动子的克隆及其参与萜类调控的分析》

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TPS3对应AvBPPS，TPS6对应AvHUS，TPS12对应AvLIS

根据fusion primer and nested integrated PCR(FPNI-PCR）引物设计原则和“2.2”项获得的Av BPPS、Av LIS和Av HUS g DNA序列，在5’端分别设计3条方向一致的特异性引物（gene specific primers，GSP），见表2。FPNI-PCR分为3轮扩增，第1轮PCR取适量阳春砂叶片g DNA，用9条通用简并引物FP1～9[15]分别与Av BPPS、Av LIS和Av HUS特异引物GSP TPS3/TPS12/TPS6-1进行热不对称PCR；第2轮PCR取第1轮PCR产物为模板，巢式特异引物FSP1分别与3个基因的特异引物GSP TPS3/TPS12/TPS6-2进行普通PCR；第3轮方法与第2轮类似，以逐步分离目的DNA片段。将3轮PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，用第3轮PCR产物直接测序或连入p LB载体测序。利用Clustal Omega对测序结果与已获得的目的基因g DNA序列分别比对，确认3’端与其g DNA序列的5’端部分序列是否重叠。对于Av BPPS，在第1次FPNI-PCR获得部分启动子序列的基础上再设计3条特异引物GSP TPS3-4～6进行第2次FPNI-PCR，将获得的延长序列与第1次扩增的序列进行拼接后，根据拼接序列5’末端设计上游引物TPS3-0F（表2），与GSP TPS3-3配对，扩增完整更长的片段。