《表1 实验中的引物序列：紫花苜蓿MsLEA4启动子的克隆及表达分析》

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《紫花苜蓿MsLEA4启动子的克隆及表达分析》

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注：下划线GAATTC为限制性内切酶EcoRⅠ酶切位点，CCATGG为限制性内切酶NcoⅠ酶切位点

用Trizol法提取1.2.2中不同胁迫和不同处理时间下的紫花苜蓿叶片RNA，反转录成cDNA，将得到的cDNA用ddH2O稀释至5ng·μl-1，用于实时定量PCR检测。以紫花苜蓿ACT2基因为内参基因，引物为F1/R1（见表1）。参考SYBR Premix Ex Taq(Takara公司）的定量PCR引物设计原则，根据MsLEA4基因序列设计实时荧光定量PCR引物F2/R2（见表1），用ABI7500荧光定量PCR仪（ABI公司，USA），采用两步法进行Real-time PCR扩增，第1步：95℃预变性30s；第2步：95℃5s，60℃34s，共40个循环，每个反应重复3次[15]。反应结束后，根据得到的Ct值，将每种处理的0h设为对照，利用2-△△ct法[16]，分别计算紫花苜蓿MsLEA4基因在ABA，GA，光照和黑暗胁迫下不同时间的相对表达量。