《表2 用于检测CaMV35S启动子的定性和实时定量PCR系统中使用的引物和荧光探针》

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《CaMV35S启动子及其在转基因作物中的应用和检测》

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由于CaMV35S启动子对转基因作物的检测具有重要意义，因此，研究者们建立了大量的转基因筛选方法，其中一些方法已被国际标准化组织（ISO）、欧洲联盟（欧盟）、中国及其他国家和地区采用，并作为转基因检测的标准方法[32-36]。表2列举了来自不同文献和检测标准的25种检测CaMV35S启动子方法[37]，分别命名为M1～M25。其中，M1被ISO 2156915通过，M13被ISO2157032通过，M1、M14、M11通过了中国的国家标准，M1、M2、M15、M16通过了中国的工业标准，而M1、M4、M12、M14被欧盟数据库收集，用于转基因成分分析。这25种方法包含了10种传统PCR方法和15种实时定量PCR方法。用于实时定量PCR方法的部分引物对，如M1、M3、M4、M5、M12和M14，也可以用于常规的定性PCR检测。另外，表2中也列出了每种方法的引物/探针相对于CaMV序列的位置和扩增子的序列大小。CaMV35S启动子是GMO中最常修改的元件之一，在不同的基因和载体上，由于来源不同的菌株或在载体构建过程中的修饰或突变，CaMV35S启动子序列可能存在差异[34]。由寡核苷酸序列的比对结果可知，转化事件176、BT11、T25、MON810和DLL2517中的CaMV35S启动子序列来源于CaMV基因组[38]（图2）。本课题组收集了玉米、大豆等一些常见转基因作物的不同转化事件中的CaMV35S序列，利用Vector NIT软件将这些序列进行比对，结果显示，这些转化事件中CaMV35S序列存在一定差异，所有比对的CaMV35S序列都不完全一致（图2）。因此，许多基于CaMV35S启动子的检测方法可用于转基因检测，但是只有部分方法通过了必要的验证过程和实验室内对少量的转基因转化事件方法验证。Morisset等[39]在TC1507玉米的CaMV35S序列中发现了一个单核苷酸多态性（SNP），检测引物/探针的结合位点出现SNP导致CaMV35S扩增效率不高。国际生命科学研究所（ILSI）请求100多个实验室使用CaMV35S和TNOS来检测转基因作物，一些实验室在CaMV35S测试中遇到了方法学缺陷，如灵敏度低、重现性低、误报或否定。Holden等[40]用8种玉米参考材料测试了5种基于CaMV35S的方法的适用性，结果表明，2种方法在一些测试材料中存在线性回归参数的缺陷和多重PCR扩增的缺陷。如果在转换载体或育种过程中，测试样品携带的CaMV35S序列被改变，那么该方法的差异性可能会导致不同的测试结果。ILSI的调查显示，大部分参与实验的实验室都希望有一种标准化的方法，这种方法可以产生一致的检测结果，而且实验的重现性更好。综合比较现有方法，还没有最优的方法可用。