《表1 建立突变体库所用引物》

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《内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶关键氨基酸位点的改造提高对烷基取代2-酮酸的催化活力》

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将来源于Symbiobacterium thermophilum IAM14863的DAPDH编码基因作为目的基因，以实验室之前构建的pET32a-stdapdh质粒作为模板，以NNK作为简并密码子，设计引物（表1）对H227位进行定点饱和突变，借助QuickChange Mutagenesis协议，利用简并密码子NNK可以编码20种氨基酸的特性，让227位除本身的组氨酸外，可以突变为其他19种氨基酸中的任何一种。PCR反应体系（50μL）:dNTPs（2 mmol/L）5μL，10×PCR缓冲液5μL，MgSO4（25 mmol/L）3μL，模板DNA（50-100 ng）1μL，上、下游引物（100μmol/L）各1μL，KOD PLUS DNA聚合酶（1 U/μL）1μL，ddH2O 33μL。PCR反应条件：95°C 5 min；95°C30 s，63°C 30 s，68°C 7 min，20个循环；68°C20 min。得到的PCR产物使用限制性内切酶Dpn I于37°C消化3 h。将消化后的PCR产物纯化后转化至E.coli BL21（DE3）感受态中，涂布在含有100μg/mL AMP的LB平板上，倒置于37°C培养箱中培养过夜。