《表2 Lcye基因的qRT-PCR引物信息》

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《小麦类胡萝卜素合成途径关键基因Lcye功能分析》

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利用实时定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）技术，测定F2群体中纯合突变型、杂合突变型和野生型植株籽粒不同发育时期（花后7、14、21和28 d）Lcye基因及其各同源基因表达量，分析突变位点对Lcye基因表达水平的影响。具体步骤为:应用RNAprep Pure植物总RNA提取试剂盒（TIANGEN Biotech，中国北京）分别提取花后7、14、21和28 d籽粒总RNA，纯合突变型、杂合突变型和野生型植株各3个生物学重复；利用PrimeScript RT Reagent试剂盒（TaKaRa Bio Inc.，Otsu，Japan）将其反转录成cDNA，置于–20℃保存备用；基于小麦Lcye同源基因cDNA序列间的保守性和差异性，设计Lcye基因的保守性引物和A、B、D基因组特异性引物（表2），对其进行溶解曲线分析和qRT-PCR产物克隆测序，验证引物保守性和特异性，普通小麦β-actin基因（AB181991）作为内参基因；反应体系:LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green（Roche Applied Sciences，USA）10μL，上下游引物0.5μmol L?1，cDNA 50 ng，ddH2O补充至20μL。反应程序:95℃10 min；95℃15 s，60℃20 s和72℃20 s，共40个循环；应用公式2?ΔΔCT计算目标基因相对表达量[23]。首先，利用同一样本中β-actin基因转录水平来校正目标基因相对表达水平；其次将野生型植株花后28 d籽粒目标基因相对表达量设为1，计算不同基因型植株的籽粒不同发育时期目标基因的相对表达量。每个样本3次技术重复，基因相对表达量用平均值±标准误差（standard error，SE）表示。