《表1 利用TILLING技术筛选Lcye突变体的引物信息》

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《小麦类胡萝卜素合成途径关键基因Lcye功能分析》

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EMS突变库筛选参照Till等[19]方法，具体步骤如下:（1）突变体DNA池构建:应用CTAB法[20]分别提取每个M2突变体植株的基因组DNA，将其存放于96孔板中。利用NanoDrop-2000超微量分光光度仪（thermo scientific）测定DNA的浓度和质量。按8个样品一组将DNA进行等量混合，构建8倍DNA混合池，4℃保存备用。（2）Lcye特异性引物设计:基于小麦Lcye同源基因序列差异，设计A、B和D基因组特异性引物。利用中国春缺体-四体材料及PCR产物测序方法，进行引物基因组特异性验证；应用CODDLE（codons optimized to discover deleterious lesions，http://www.proweb.org/coddle/）软件分析扩增区域是否对基因功能起重要作用。最终4对Lcye特异性引物，用于突变体筛选（表1）。（3）PCR扩增与异源双链生成:以DNA混合池为模板进行PCR扩增，反应体系:DNA 50 ng，PreMix 7.5μL，10μmol L?1上、下游引物各1μL，ddH2O补足至15μL；反应程序:首先95℃变性5 min；然后95℃变性30 s，退火温度从66℃开始，每个循环降低0.3℃，退火45 s，72℃延伸1.5 min，重复35个循环；72℃延伸10 min；然后99℃10 min，85℃1 min，退火温度从85℃开始，每个循环降低0.5℃，退火时间30 s，共99个循环；最后16℃保温备用。如果DNA混合池样本目标片段中含有突变位点，扩增产物经过反复变性、复性将形成野生型和突变体扩增片段的异源双链（即含有错配碱基）。（4）CEL I酶切:用特异性识别并切割错配碱基的核酸内切酶CEL I剪切异源双链核酸分子。酶切反应体系:10×消化缓冲液2μL，CEL I 1μL，异源双链DNA 15μL，ddH2O补足至20μL。45℃反应20 min，随后加入EDTA（0.25 mol L–1）5μL终止酶切反应。（5）非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测:利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术检测CEL I酶切片段，筛选获得含有突变位点的阳性DNA混合池。对阳性DNA混合池中的每个样本DNA逐一与野生型DNA进行等量混合，重复上述步骤，筛选获得阳性突变体单株。（6）突变样本克隆测序:对突变个体PCR产物进行克隆测序，鉴定突变类型和位置。