《表2 布氏鲳鲹VEGFA基因克隆和荧光定量引物》

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《布氏鲳鲹VEGFA基因克隆与组织表达分析》

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利用实时荧光定量对布氏鲳鲹的不同组织检测VEGFA基因表达。在VEGFA基因序列的ORF区域内设计实时荧光定量PCR引物（表2），以β-Actin为内参基因作为对照组，使用ABI QuantStudio TM 6 Flex系统进行VEGFA基因RT-PCR，检测布氏鲳鲹各个组织中的VEGFA表达分布情况。本实验反应程序为（Three step+melt），Step 1:95℃30 s；Step 2:95℃5 s、60℃（根据不同引物Tm值）30 s、72℃20 s、40 Cycles；Step 3:95℃15 s；Step 4:Melt Curve 60℃～95℃，increment 0.5℃，every 5 s。反应体系为10μL:SYBR Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus）5μL，RNase，DNaseFree Water 4.1μL，阳性模板c DNA 0.5μL，Forward Primer（10μmol/L）0.2μL，Reverse Primer（10μmol/L）0.2μL。对每个样本进行3个平行设置，通过实时荧光定量PCR得到VEGFA基因在不同组织中的相对表达量，采用相对标准曲线法计算，并利用GraphPad Prism5.0软件进行实验数据处理和方差分析及绘图。