《表1 hiTAIL-PCR扩增引物》

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《茶树N-甲基转移酶基因启动子克隆及功能分析》

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茶树基因组DNA提取采用改良CTAB法；启动子扩增按照文献[15]的hiTAIL-PCR法，即以YH-NMT1基因5'端序列为基础，设计3条特异的巢式引物S1-0、S1-1和S1-2，结合4条LAD简并引物及AC1（表1）进行3轮巢式PCR扩增。首轮扩增以50 ng的茶叶基因组DNA为模板，以S1-0和LAD1—LAD4引物进行扩增；扩增产物稀释50倍后用S1-1和AC1引物组合进行第2轮扩增；再将第2轮扩增产物稀释10倍为模板用S1-2和AC1引物组合进行第3轮扩增，完成第1次扩增。第1次扩增产物测序后，根据序列特点在其5'端再设计3个特异性巢式PCR引物S2-0、S2-1、S2-2，结合4条LAD简并引物及AC1（表1）同上进行第2次扩增并测序。两次扩增产物PCR拼接验证克隆后连接至pMD18-T载体转化大肠肝菌DH5α并筛选出重组子。将得到的启动子用启动子在线分析软件PLACE（http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE）和Plant CARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html）进行转录调控元件分析。