《表1 引物扩增反应阳性的新型隐球菌DNA引物》

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《重组酶聚合酶扩增技术检测新型隐球菌DNA》

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凝胶法RPA扩增新型隐球菌DNA引物。引物设计原则参考Twist Dx公司说明（http://www.twistdx.co.uk/），在新型隐球菌5.8SrRNA编码基因区域共设计6对引物，见表1用凝胶法RPA基础试剂盒筛选可稳定扩增出新型隐球菌DNA片段引物50μL扩增反应体系包括:溶解剂20μL，10μmol/L的引物F、引物R各1.5μL，ATCC32609的DNA模板2μL，ddH2O补足至48μL，混匀后即刻加入激活剂2μL，瞬时离心后放置在37℃水浴锅中，反应20min。扩增后，取各引物1.5%琼脂糖凝胶电泳后观察反应结果，阳性视为可稳定扩增出新型隐球菌DNA引物。另取ATCC32609菌株悬液以1∶10、1∶102、1∶103、1∶104、1∶105稀释，半定量法检测凝胶电泳阳性引物和试剂对ATCC32609标准株的灵敏度，。以凝胶电泳反应阳性引物的扩增产物测序结果为目标片段，通过PUBMED网站进行blast比对，分析凝胶电泳阳性引物是否为新型隐球菌编码核糖体RNA的DNA片段。凝胶电泳阳性引物扩增150株阴性质控菌株，观察是否存在扩增条带，验证该反应的特异性。