《表1 引物设计表：青钱柳鲨烯合成酶(CpSS)全长基因的克隆、分析与表达》

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《青钱柳鲨烯合成酶(CpSS)全长基因的克隆、分析与表达》

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根据本实验室转录组测序的青钱柳CpSS基因的cDNA序列分别设计5’和3’RACE引物（见表1），采用Clontech公司SMARTerTM RACE cDNA Amplification试剂盒，以合成的5’和3’RACE cDNA为模板进行PCR扩增，分别获得CpSS的5’-RACE片段和3’-RACE片段。PCR扩增体系（50μL):5’和3’RACE cDNA，2.5μL；2×SeqAmp Buffer，25μL；SeqAmp DNA Ploymerase，1.0μL；PCR-Grade H2O，15.5μL；10×UPM，5μL；5’和3’GSP，1μL。反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，68℃退火30 s，72℃延伸3 min，35次循环；72℃终延伸10 min。应用凝胶回收试剂盒对PCR特异性扩增产物回收纯化，将纯化产物与pUC19载体连接，转化克隆进入感受态细胞，送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。采用DNAstar软件将获得的5’和3’序列进行拼接，得到青钱柳CpSS全长基因序列。根据拼接的CpSS的全长基因序列设计全长克隆引物（引物见表1），克隆CpSS的全长基因，以验证拼接的序列。