《表1 RT-qPCR反应引物》

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《基于Wnt/β-catenin信号通路的艾拉莫德对白介素1β诱导的大鼠退变软骨细胞基质代谢的影响研究》

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注：GSK-3β=糖原合成酶激酶3β，MMP=基质金属蛋白酶，GAPDH=甘油醛-3-磷酸脱氢酶

从培养箱中取出细胞培养皿，弃去培养基，用预冷无菌PBS冲洗2次，采用Trizol法提取RNA，每10 cm平皿加入1 ml Trizol，室温放置5 min，并轻摇培养皿，用离心管吸取裂解液。用微量移液器吸取0.2 ml氯仿，轻摇混匀，室温放置5 min，4℃离心机，12 000 r/min离心15 min（离心半径为10 cm），用移液器吸取水相至新的离心管，重复上一步骤。加入0.5 ml异丙醇，轻摇混匀，室温放置10 min，4℃离心机，12 000 r/min离心15 min（离心半径为10 cm）后弃上清液，4℃预冷，加入1 ml的75%乙醇溶液[含焦炭酸二乙酯（DEPC）水]，7 500 r/min离心15 min（离心半径为10 cm）后弃上清液，重复上一步骤。根据沉淀的量加入20～100μl的DEPC水融解RNA，-80℃保存备用。采用超微量分光光度计检测RNA浓度，选择测量RNA的界面，用DEPC水调整2次，擦镜纸擦净后加样本3μl，出现数值后记录浓度和A260/A280值。采用凝胶电泳检测RNA完整性，1.2%琼脂糖凝胶电泳检测质量，出现两条电泳条带，即18S和28S rRNA，只要18S和28S rRNA带亮，且28S rRNA大约为18S rRNA的两倍，说明提取RNA未发生降解。按照试剂盒说明书合成cDNA，将制备好的cDNA进行RT-qPCR，RT-qPCR反应引物见表1。采用9700型实时荧光定量PCR仪进行扩增，反应条件：第一阶段95℃3 min；第二阶段95℃变性30 s、60℃退火34 s、72℃延伸60 s，共40个循环；第三阶段95℃15 s、60℃1 min、95℃15 s。各mRNA和内参分别进行RT-qPCR，每个样品重复3次，采用2-ΔΔCT法计算mRNA相对表达水平。