《表2 裂皮鹅膏转录组MSDIN基因序列验证的特异性引物》

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《剧毒裂皮鹅膏转录组测序与毒肽相关基因家族分析》

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以“MSDIN”已知序列为检索条件比对，在U-nig-ene编码的氨基酸序列中进行搜索，得到符合条件的多肽氨基酸序列及Unigene编号，由Unigene编号获得相应的CDS序列。根据CDS序列在两边设计特异性引物（表2），以裂皮鹅膏cDNA为模板进行PCR扩增和测序，验证MSDIN家族基因序列的正确性。PCR体系如下:20μL反应体系:200 ng/μL的cDNA模板1μL，10μmol/L上下游引物各1μL，PCR酶（1.25 U/μL）0.5μL，2×Mix 10μL（Tks Gflex TM DNA Polymerase Low DNA，TaKaRa），加水补齐至20μL。反应条件（采用Touchdown方法）:94℃预热4 min；94℃变性30 s，62℃退火20 s，72℃延伸30 s，5个循环；94℃变性30 s，55℃退火20 s，72℃延伸30 s 10个循环；94℃变性30 s，53℃退火20 s，72℃延伸30 s 20个循环（退火温度每一个循环降0.2℃）。PCR产物经切胶回收后连接到pUC19-T载体（TaKaRa），并转化大肠杆菌感受态细胞。挑选3～6个正确的转化子送华大基因进行测序验证。