《表1 引物序列及用途：拟南芥转录因子基因WRKY72的特性分析及其抗逆功能鉴定》

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《拟南芥转录因子基因WRKY72的特性分析及其抗逆功能鉴定》

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将Col-0野生型种子铺于1/2 MS培养基上，4℃层积处理3 d，再移入温室中竖直生长。7 d后，将长势相同的幼苗分别移至200 mmol/L NaCl（MP biomedicals，美国）、50μmol/L脱落酸（ABA，Invitrogen，美国）、12.5%聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）8000（MP biomedicals，美国）、10μmol/L百草枯（meythl Viologen，MV，Sigma-Aldrich，美国）、低磷（low phosphate，LP，10μmol/L PO43-）、低氮（low nitrogen，LN，100μmol/L NO3-）、低钾（low potassium，LK，100μmol/L K+）、5%葡萄糖（MP biomedicals，美国）培养基上，以及4℃冷害、38℃热害处理1、3、12 h。其中，200 mmol/L NaCl、50μmol/L脱落酸、10μmol/L百草枯和5%葡萄糖培养基均根据试剂浓度及相对分子质量换算后按比例加入培养基；12.5%PEG8000培养基则是由25%PEG8000溶液等体积渗透于1/2MS固体基中配制而成；LP（10μmol/L PO43-）培养基用NH4H2PO4替代KH2PO4，PO43-浓度为10μmol/L；LN（100μmol/L NO3-）培养基中NO3-浓度为100μmol/L；LK（100μmol/L K+）培养基中KNO3、KH2PO4分别被NH4NO3、NH4H2PO4代替，K+终浓度为100μmol/L。液氮速冻收样，储存于-80℃。使用植物RNA试剂盒（Omega biotek，美国）提取RNA，然后使用去除DNA试剂盒（Ambion，立陶宛）除去基因组DNA。以2.5μg RNA、Oligo（dT）18（Fermentas，立陶宛）和RNase H-MMLV（TaKaRa，大连）反转录成cDNA。用稀释5倍的c DNA和SYBR GreenⅠ（CWBIO，北京）试剂以及定量引物混合于96孔板上，并在CFX96实时PCR仪（Bio-Rad，美国）上进行实时荧光定量PCR（qRT-PCR）。逆转录反应体系为:1μL Oligo（dT）18与2.5μg总RNA混合，加ddH2O补足至12.5μL，70℃加热5 min，冰上放置2 min；再加入1μL 10mmol/L dNTPs，0.5μL 40 U/μL RNA酶抑制剂（Fermentas），4μL 5×First-Strand缓冲液，1μL H-MMLV酶；混合后42℃反应1 h，70℃反应10 min。实时荧光定量PCR反应体系为:5μL 2×SYBR Green I premix，0.2μL 20μmol/L正反向引物，2μL稀释10倍的cDNA，以ddH2O补足至10μL。反应程序按照试剂盒说明书进行。qRT-PCR的引物使用PrimerSelect程序（DNASTAR Inc.USA）设计，选择3'UTR区域，扩增长度为75～250 bp。通过NCBI数据库中的BLASTn搜索和熔解曲线检查每对引物的特异性和扩增效率，设计的qRT-PCR引物见表1。每个反应进行3次生物学重复和两个技术重复，并通过SPSS 17.0的t检验确定显著性（P≤0.05）（Yan et al.，2014） 。半定量qRT-PCR检测时，首先从突变体与Col-0叶片中提取总RNA并逆转录为c D-NA，使用WRKY72的编码区引物进行PCR，内参对照基因为Actin2，总体系为20μL，其中逆转录体系及程序同1.4，半定量PCR体系为:2μL 10×Taq缓冲液，0.5μL 10 mmol/L dNTPs，0.5μL 20μmol/L正、反向引物，1μL cDNA模板和1 U的Taq DNA聚合酶，以ddH2O补足至20μL。PCR程序:94℃预变性3 min；94℃变性30 s，50℃复性30 s，72℃扩增（1 kb/min），分别设置20、25、35三个循环；最后72℃保温10 min。用1%琼脂糖凝胶电泳进行分析，溴化乙锭对凝胶进行染色，凝胶成像仪（JS-680B，培清，上海）进行拍照。