《表1 OsPKS1 CRISPR构建引物及鉴定引物》

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《酮类物质合成酶OsPKS1和Os PKS2对水稻花粉外壁形成的作用》

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通过基因分析网站（http://gramene.org）确定基因外显子，使用蛋白分析网站（http://smart.embl-heidelberg.de）预测基因保守区域，在CRISPR-P 2.0（http://crsripr.hzau.cn/CRISPR2）网站输入保守区域序列信息来寻找符合条件的靶标，根据CRISPR-Cas9原理在PAM序列（protospacer adjacent motif-NGG）上游20个碱基处设计靶点，正向引物选取第9—20位碱基作为主体并在两端加上接头，反向引物选取第1—12位碱基作为主体，在两端加上接头。选取2个靶点来设计引物，具体引物序列（表1）。通过文献[33]中描述方法，利用通用引物和设计引物Os PKS1-T1和OsPKS1-T2构建CRISPR/Cas9质粒，将质粒转入到EHA105农杆菌感受态中，再将农杆菌转入到野生型水稻愈伤组织来获得ospks1单突变体；转入ospks2愈伤组织获得ospks1 ospks2双突变体。转基因植株通过PCR产物测序方法鉴定基因型，引物信息见表1。