《表2 OsPGL1双靶点CRISPR/Cas9载体构建的引物》

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《1种简单快速高效的双靶点CRISPR/Cas9载体构建方法》

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注：GGC表示用于U3启动子的正向引物靶点接头；GCC表示用于U6a启动子的正向引物靶点接头；GTTTT表示用于U6a启动子的正向引物靶点的3′端接头；GTT表示用于U6b启动子的正向引物靶点接头；AAAC表示用于U3/U6b启动子的反向引物靶点接头；CTCTAAAAC表示用于U6a启动子的反向引物靶点

为了获得高效的连接体系，以水稻基因OsPGL1[22]为例，设计2对靶点引物（表2），比较了4种不同靶点、gRNA2-LacZ-PU6a和载体浓度组合（表5）在以下3种连接方法下的连接效率。方法1：先分成两管反应，将靶点1与外源片段gRNA2-LacZ-PU6a连接，靶点2与线性化的pRC3连接，各10μL反应体系（1μL 10×NEB T4 DNA Ligase Buffer，40U T4DNA Ligase），利用PCR仪10℃5min、20℃5min，反应5个循环，然后将两管10μL反应产物混合在一起，利用PCR仪10℃5min、20℃5min，反应10～15个循环。方法2：先将靶点1、靶点2与外源片段gRNA2-LacZ-PU6a室温连接30min，然后加入线性化的pRC3，总共20μL反应体系（2μL 10×NEB T4 DNA Ligase Buffer，80U T4 DNA Ligase），利用PCR仪10℃5min，20℃5min，反应10～15个循环。方法3：将靶点1、靶点2、外源片段gRNA2-LacZ-PU6a和线性化的pRC3直接混合在一起，总共20μL反应体系（2μL 10×NEB T4DNA Ligase Buffer，80UT4DNA Ligase），利用PCR仪10℃5min，20℃5min，反应10～15个循环。