《表2 酶切连接体系：大葱ALS基因的克隆及其CRISPR/Cas9载体的构建》

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《大葱ALS基因的克隆及其CRISPR/Cas9载体的构建》

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根据CRISPR替换原则，以拟南芥ALS基因的氨基酸序列为标准，选择在大葱ALS基因的Pro197、Ser653 2个位点的旁侧分别设计19-nt引物（靶点预测网站:http://www.crisprscan.org/），将一个19 nt靶点序列替换引物F0/BsF中的19-nt N；另一个19 nt靶点的倒转互补序列替换-R0/BsR中的19 nt N（表1）。以pCBC-MT1T2为模板，进行PCR扩增获得MT1-g R NA-Sc-MT2片段。PCR扩增体系为：0.5μL EX Taq，5μL EX Buffer，4μL dNTP，4个引物各1μL（10μmol/L），模板pCBC-MT1T2 2～4 ng，加水补足到50μL。PCR程序为：94℃预变性2 min；94℃变性15 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，30个循环；72℃，7 min；4℃保存。用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的片段，建立酶切连接体系，将目的片段连接到载体PBUE911中（表2）。将重组载体转化至大肠杆菌感受态Trans1-T1，在含kan（卡那霉素）的LB平板上进行筛选，然后挑单克隆，用Os U3p-F3和TaU3p-R引物进行菌液PCR鉴定，阳性克隆用Os U3p-F3和TaU3p-F2引物测序（图7）。