《表3 10个水稻基因双靶点CRISPR/Cas9载体构建的引物》

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《1种简单快速高效的双靶点CRISPR/Cas9载体构建方法》

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为了探究本研究构建的载体系统是否适用于水稻中其他的基因，选用10个已报道的水稻基因YS83、YGL2、TCD5、OsFLN1、YSA、OsCYO1、NTRC、OsClpP5、OsTLP27和OsSKIPa[23-32]，每个基因分别设计3对靶点引物（表3），构建到pRC3和pRC6b上，共计20个载体。连接产物转化大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞，37℃培养过夜，LB培养皿上蓝白斑明显，每个皿上挑3个蓝斑，用MluⅠ和BamHⅠ酶切验证后送公司测序，酶切和测序结果均显示为正确的克隆，阳性率为100%（图4），且测序显示无突变。这说明该方法适用于水稻基因的双靶点CRISPR/Cas9载体构建，而且非常高效。