《表1 Overlap PCR扩增EF-Tu基因的引物序列》

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《牛支原体EF-Tu基因的克隆表达、亚细胞定位及间接ELISA方法建立》

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下划线示限制性内切酶BamHⅠ、SacⅠ酶切位点；斜体示突变位点The restriction endonuclease cleavage sites of BamHⅠand SacⅠare expressed by underlines，and the mutation sites are represented in italics

参照Uniprot数据库中M.bovis PG45标准株Elongation factor Tu（E4PZX2）的蛋白序列，获得完整的基因序列。利用在线分析软件ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）对EF-Tu蛋白的理化性质进行预测；利用SignalP（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）预测该蛋白的信号肽；利用TMHMM2.0Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）预测该蛋白的跨膜结构；利用PROSCAN（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_proscan.html）查找该蛋白功能位点；利用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）对该蛋白的二级结构进行在线分析。序列分析发现该蛋白序列中有1个色氨酸密码子（TGA）在大肠杆菌中为终止密码子，运用Overlap PCR技术扩增EF-Tu全序列（将序列中的TGA突变为同义密码子TGG），在引物上、下游分别加入BamHⅠ和SacⅠ酶切位点（表1）。PCR反应体系均为:灭菌双蒸水31.5μL、5×Prime STAR Buffer（Mg2+plus）10μL、dNTP Mixture 1μL、10μmol·L-1上、下游引物各1μL、模板DNA 2μL、Prime STAR HS DNA Polymerease0.5μL。PCR反应条件:94℃预变性5min；94℃1min，55℃45s，72℃60s，反应35个循环；72℃延伸10 min；反应程序结束后，在PCR管中加入2μL普通的Taq E，轻轻振荡，混匀，瞬离，72℃反应20 min，可以在PCR产物平末端添加A尾。PCR产物利用DNA回收试剂盒回收与pMD19-T载体进行连接，连接体系总体积为10μL:灭菌双蒸水4μL，SolutionⅠ1μL，加A尾的EF-Tu PCR产物4μL，pMD19T1μL，16℃过夜连接。取连接产物5μL转化至大肠杆菌50μL感受态细胞Trans T1，通过菌液PCR和双酶切鉴定为阳性的质粒送上海生工生物工程股份有限公司测序，通过NCBI在线比对，将测序正确的质粒命名为pMD19T-EF-Tu。