《表1 MSnox基因Overlap PCR扩增引物序列》

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《滑液支原体NADH氧化酶的酶学活性及亚细胞定位研究》

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注：下划线为Bam H I和Xho I酶切位点序列；加粗代表突变位点.

根据MS WVU1853（CP011096.1）的nox基因（VY93＿02845）序列设计4对引物（表1），以提取的MS WVU1853基因组DNA为模板，分别进行第一轮PCR扩增获得MSnox各个片段。将获得的各个片段回收后，混合作为模板，用两端引物（MSnox 1F和MSnox 4R）进行第二轮PCR扩增。PCR反应体系：2×Prime STAR MAX Premix 20μL，上、下游引物各1μL（0.4μmol/L），MS WVU1853基因组DNA模板1μL（100 ng），ddH2O补足至40μL。PCR反应条件：98°C 5 min；95°C 30 s，55°C 30 s，72°C 30s，30个循环；72°C 10 min；16°C 10 min。将扩增得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，确认大小与预期相符后切胶回收，即为MSnox基因全长序列。