《表1 Lg-mnp2和Lg-mnp3全长基因克隆中使用的引物》

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《偏肿革裥菌系统发育与Lg-mnp2和Lg-mnp3基因克隆及结构特征》

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首先根据GenBank已报道的白腐菌不同MnPs基因序列，进行同源比对查找保守区，设计用于扩增DNA和RNA片段的上下游引物1F、1R，以基因组DNA为模板，扩增基因Lg-mnp片段，用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，观察电泳图确定目的条带。在250 m L三角瓶中加入70 m L的LNAS培养基，高压灭菌后加入5 m L过滤除菌的15%葡萄糖液和2 g青杨（Populus ussuriensis）木屑，接入5块菌饼，28℃静止培养至9 d，收取在培养液内的菌丝体，液氮冻存于-80℃冰箱，用E.Z.N.A.TM总RNA提取试剂盒及相关方法提取总RNA。将获得的DNA片段经BLAST比对确认属于Mn P基因后，以总RNA为模板，用引物1F和1R，使用Ta KaRa两步法RT-PCR试剂盒及其相关方法反转录扩增c DNA片段。得到的c DNA片段与DNA片段进行比对后，根据c DNA片段设计出用于3'RACE的特异性引物GSOP与GSIP，以总RNA为模板，使用Ta KaRa的3'RACE试剂盒扩增目的基因的3'端。根据克隆到的DNA片段、c DNA片段和3'RACE产物拼接后的序列，设计特异性基因组上下游引物GF、GR，以基因组DNA为模板，扩增该引物对范围内的DNA序列。然后根据该DNA基因两翼序列设计5'和3'端walking PCR引物SP1、SP2、SP3，设计方向为需要扩增的未知区域方向，以基因组DNA为模板，利用Ta KaRa公司的染色体步移试剂盒（Genome Walking Kit）及相关方法克隆基因的5'上游和3'下游序列，取第2、3轮PCR反应液各2μL，用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳检测，观察电泳图确定目的条带。所有PCR产物目的片段凝胶回收、连接、转化、测序，对有效序列进行拼接后获得全长DNA基因，用相关软件对基因及编码的蛋白序列进行生物信息学分析[13-15]。实际应用于扩增Lg-mnp2和Lg-mnp3全长基因的所有引物见表1。