《表1 本研究中使用的引物序列》

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《棉花CRISPR/Cas9基因编辑有效sgRNA高效筛选体系的研究》

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以YZ-1基因组DNA为模板，克隆Gh MAPKKK2 （Gh＿D10G0119）、Gh AE （Gh＿D09:3656310..3658852）、Gh PDS （Gh＿D07G1160）、Gh CLA1 （Gh＿D10G1640）基因部分序列用于寻找合适的靶序列，靶序列的设计基于以下原则，一是在四倍体棉花YZ-1中，A组和D组的基因组序列完全一致；二是GC含量在40%～60%之间；三是有合适的限制性内切酶位点。将靶序列单链DNA经过DNA复性反应后连接于以Bbs I酶切获得的Gh U6-5P::GUS-sg RNA和Gh U6-5P-2::GUS-sg RNA线性化载体。退火反应体系为10μmol L-1的上下游靶序列各10μL （表1），复性程序为:95℃每5 s降低0.5℃至20℃。经测序验证获得上述Gh U6-5P::MAPKKK2-sg RNA、Gh U6-5P::AE-sg RNA质粒后，再将上述2种质粒以酶切连接的方式分别连接在以Kpn I、Xba I酶切获得的p CAMBIA1300表达载体和和Cas9基因表达载体上，分别命名为Gh U6-5P::MAPKKK2-sg RNA-1300、Gh U6-5P::AE-sg RNA-1300和Gh U6-5P::MAPKKK2-sg RNA-Cas9、Gh U6-5P::AE-sg RNA-Cas9。经测序验证获得上述Gh U6-5P-2::PDS-sg RNA、Gh U6-5P-2::CLA1-sg RNA、Gh U6-5P-2::MAPKKK2-sg RNA和Gh U6-5P-2::AE-sg RNA质粒后，再将其以酶切连接方式连接在以Pac I、Spe I酶切获得p Cl Cr VA病毒载体上，命名为Gh U6-5P-2::PDS-sg RNA-Cl Cr VA、Gh U6-5P-2::CLA1-sg RNA-Cl Cr VA、Gh U6-5P-2::MAPKKK2-sg RNA-CLCr VA和Gh U6-5P-2::AE-sg RNA-CLCr VA。上述重组质粒酶切检测正确后均转化农杆菌GV3101，命名同表达载体名称。