《表1 本研究使用的引物序列》

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《露地菊(Chrysanthemum×grandiflora)CgDREB基因克隆和生物信息学分析》

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从课题组前期构建的露地菊转录组数据库中获得该基因的最大开放阅读框（ORF），利用Primer Premier 5.0设计上游引物CgDREB-F和下游引物CgDREB-R（表1），以反转录产物为模板，参照Blend Taq（TOYOBO）说明克隆基因，反应体系为50μL，包括10×PCR Buffer For Blend Taq 5μL，Blend Taq 0.5μL，上游、下游引物各1μL，c DNA 2.5μL，2 mmol/L dN-TPs 5μL，distilled water 35μL。采用三步法按如下反应程序进行扩增：预变性94℃2 min；变性94℃30 s，退火55℃30 s，延伸72℃1 min，35个循环；4℃foreve。1%琼脂糖电泳后参照Gel Extraction Kit（OMEGA）说明回收目的片段，过夜连接载体PMD18-T（TOYOBO），连接产物转化大肠杆菌DH5α，挑单菌落PCR验证后，送往生物公司测序。