《表1 实时荧光定量PCR引物》

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《肝豆灵抑制Notch信号通路干预铜负荷致肝纤维化大鼠肝脏上皮-间质转化》

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由上海生工生物工程有限公司设计并合成引物（见表1），依据以下步骤测定各基因mRNA的表达水平。（1）RNA提取:裂解组织，按5∶1的标准加入氯仿，离心后上清液加入等容积异丙醇，加入1mL 75%乙醇，弃上清，加入20μL DEPC水保存。（2）cDNA合成:反应体系为RNA 8.0μL、Oligo（dT）1.0μL、Buffer 4.0μL、dNTP 2.0μL、RNasin 1.0μL、M-MLV 1.0μL，PCR仪器上42℃60 min，70℃5min，取出反应液即为cDNA；（3）实时PCR:反应体系为2×SYBR Green Real-time PCR mixture 10μL，10μmol正向引物及反向引物各0.4μL，2×ROXⅡ0.4μL，cDNA 2.0μL，双蒸水6.8μL，95℃30s预变性，95℃5s，60℃34s扩增40个循环后，95℃15s，60℃60s，95℃15s。用2-ΔΔC（t）法计算待测基因mRNA的相对表达水平。