《表1 用于ITS、LSU、EF和BTU2基因PCR扩增的引物信息》

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《内蒙古苹果树腐烂病病原菌鉴定》

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以提取的菌株总DNA为模板，分别采用通用引物ITS1/ITS4、NL1/NL4、EF1-688F/EF1-1251R和Bt2a/Bt2b（表1）扩增病原菌的内转录间隔区（Internal Transcribed Spacer，ITS）、核糖体大亚基片段（Ribosomal Large Subunit，LSU）、转录延长因子（Elongation Factor 1-alpha，EF）和β微管蛋白（β-tubulin，TUB2）。PCR反应体系均为10×PCR buffer 2.5μL，dNTP 2.0μL（2.5 mmol·L-1），引物（10μmol·L-1）各1μL，Taq酶0.5μL，DNA 1μL，灭菌双蒸水补足至25μL。PCR反应条件依次为：94℃3 min；94℃30 s，退火30 s（各引物退火温度见表1），72℃1 min，35个循环；72℃10 min。最终的PCR扩增产物经1.2%的琼脂糖电泳检测，用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（Tiangen，北京）回收纯化，连接pMD19-T载体，转化到E.coli菌株DH5α感受态细胞，涂布于含Amp的LB平板上，37℃培养过夜，挑选单菌落将PCR扩增鉴定阳性的单克隆送至上海生工生物工程股份有限公司进行测序。