《表1 靶向人源smad3基因敲除的gRNA序列》

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《CRISPR/Cas9介导Smad3基因敲除对人腹膜间皮细胞增殖和凋亡的影响》

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利用美国麻省理工学院CRISPRDesign在线软件（http://crispr.mit.edu/）进行g RNA的设计，然后在NCBI的Primer-Blastt对所设计g RNA进行特异性验证，共设计两对g RNA，见表1。设计完成的g RNA由北京六合华大基因科技有限公司合成。BbsⅠ限制性内切酶在4℃条件下酶切PX459质粒过夜，电泳并切胶回收酶切后的质粒；将合成的g RNA正义链和反义链复性处理后形成双链，反应体系为正、反义链各1μL（100μM），T4多核苷酸激酶（PNK，NEB)0.5μL，T4连接酶缓冲液（NEB)1μL，DEPC处理水补足至10μL，反应条件：37℃30 min，95℃5 min，降至25℃（5℃/min）；将寡核苷酸双链与切胶回收后的质粒用快速连接酶(NEB）进行重组，反应体系：BbsⅠ酶切后的质粒（50 ng），寡核苷酸双链1μL，快速连接酶1μL，2×快速连接酶缓冲液5μL，1.5μL ATP(10 mmol/L）和1.5μL的10×Plasmid Safe缓冲液，DEPC处理水补足至15μL。反应条件：37℃30 min；将重组后的质粒（5～10μL）加入到50μL的DH5α感受态中，轻弹混匀后冰浴30 min，4℃热激90 s，冰上静置2 min，然后涂板与含氨苄抗性的琼脂糖培养基。37℃培养箱过夜后挑3～5个单克隆菌落继续摇菌培养，提取质粒DNA送北京六合华大基因科技有限公司用通用引物U6进行测序验证。