《表2 Cas13a和Cas13b靶向lig4的gRNA序列》

《表2 Cas13a和Cas13b靶向lig4的gRNA序列》   提示:宽带有限、当前游客访问压缩模式
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《CRISPR/Cas13系统敲减HEK293T细胞ku70和lig4基因表达》


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针对人ku70(GeneID:2547)和lig4(GeneID:3981)2个基因的CDS序列分别设计对应的gRNA(表1和表2),并由北京六合华大基因科技有限公司合成gRNA oligo引物。参考Thermo Fisher Scientific的Fast Digest BpiⅠ说明书线性化Cas13a、b的U6质粒。将上述合成的引物退火后与线性化的U6质粒16℃过夜连接,详细体系见TaKaRa T4 DNA Ligase(#2011A)说明书。将连接好的环状DNA转化到大肠杆菌Escherichia coli DH5α感受态细胞中,并划线涂板。第2天将扩大培养的单克隆菌落(AmpR)进行Sanger测序,测序引物为U6(human):CCGTAACTTGAAAGT ATTTCG,将测序正确的菌液在氨苄青霉素终浓度为100μg/mL的LA培养基中扩大培养,并用Omega bio-tek公司的Endo-Free Plasmid Mini Kit II(#D6950)进行质粒抽提备用,为后续HEK293T细胞转染做准备。