《表1 gRNA靶向序列》

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《人胚胎干细胞多基因同时抑制系统的建立》

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合成8对gRNA寡核苷酸链，每对分别退火形成双链，通过Bsm BⅠ酶切位点分别插入pgRNA-CKB载体（73501，Addgene，美国）。其中，7个基因的gRNA序列来自已发表的文章[9]:OCT4、SOX2、NANOG、Bcl-2相关永生基因3（Bcl-2 associated athanogene 3，BAG3）、Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶1（Rho associated coiled-coil containing protein kinase 1，ROCK1）、糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）和电压门控钾通道Eag相关H家族2型[potassium voltage-gated channel，subfamily H（Eag-related），member 2，HERG]。对于orthodenticle人同源盒基因2（orthodenticle homeobox 2，OTX2），在该基因转录起始位点（transcription start site，TSS）上、下游125 bp的范围内，通过麻省理工学院的在线CRISPR工具设计gRNA序列（表1）。用特异的引物（表2）分别PCR扩增8个gRNA表达模块[U6-gRNA-改良茎环结构（modifi ed stem loop，MSL）]，从而在每个gRNA表达模块两侧引入BsaⅠ酶切位点。